Křemíková nanotechnologie „ve zkumavce“

Křemík, jeden z nejběžnějších chemických prvků v zemské kůře, nepatří mezi hlavní prvky, které tvoří živé buňky, a ve vysokých koncentracích je dokonce toxický. Mnoho organismů, od hub a radiolárií až po obiloviny, ho však aktivně využívá k vytváření základních prvků svých těl. Mezi nejzručnější tvůrce struktur z polymerovaného oxidu křemičitého patří početná a rozšířená skupina rozsivek. Ve své „křemíkové nanotechnologii“ tyto mikrořasy nepoužívají extrémně vysoké teploty a „těžkou chemii“, proto jsou předmětem bedlivé pozornosti moderních biotechnologů.

Schopnost rozsivek obratně manipulovat s křemíkem, který se vyvíjel a byl „optimalizován“ po desítky milionů let, je pro vědce ve věku vyspělých technologií velmi zajímavá. Termín „rozsivková nanotechnologie“ (nanotechnologie rozsivek) byl představen v roce 1988 americkým výzkumníkem R. Gordonem (Gordon, Aguda, 1988). Nyní, ve vztahu k celé skupině pigmentovaných heterokontů, mezi které patří nejen rozsivky, ale i chryzofyty, můžeme hovořit o křemíkové nanotechnologii (křemíkové nanotechnologie) v širokém smyslu (Gračev et al., 2008). Není proto divu, že makro- a mikroprocesy morfogeneze a samotná struktura křemičitých chlopní řas dnes přitahují pozornost specialistů z nejrůznějších oborů.

Díky svým optickým vlastnostem a velkému povrchu, na kterém lze imobilizovat protilátky a enzymy, lze schránky rozsivek použít jako biosenzory (Gale et al., 2009; Sheppard et al., 2012). Nedávno byla prokázána možnost jejich využití pro cílené podávání léků špatně rozpustných ve vodě, jako jsou například léky proti rakovině (Delalat et al., 2015).

Mezi všemi jednobuněčnými organismy, které vytvářejí anorganické struktury mikro- a nanorozměrů, se rozsivky vyznačují zvláštní rozmanitostí forem. Podle typu symetrie skořápky se rozsivky dělí do tří hlavních skupin: centrické s radiální a bipolární symetrií (nejstarší skupina) a pennaté s bilaterální symetrií. Pennaté se zase dělí na stehové a bezešvé podle přítomnosti nebo nepřítomnosti štěrbiny na chlopni.

Schránky rozsivek jsou také předmětem tribologie, vědy, která studuje kontaktní interakce pevných deformovatelných těles během jejich relativního pohybu. Zvláštní pozornost je věnována metodám spojování buněk řas do kolonií pomocí spojovacích křemičitých struktur a adhezivních látek, které vylučují (Crawford, Gebeshuber, 2006, Gebeshuber, 2007). Rozsivky by se také mohly stát ekonomickou náhradou za nanotechnologie, jako je planární litografie, která se používá k vytváření „plochých“ polovodičových součástek, integrovaných obvodů a některých supravodivých nanostruktur. Jednou z fází této technologie je vytvoření reliéfního vzoru v citlivé vrstvě na povrchu substrátu, opakujícího topologii mikroobvodu. Kéž by se rozsivky daly „objednat“ do specifického vzoru!

Tento sen nadchýná mnoho lidí – jeho realizace by se mohla stát základem pro zásadně novou biotechnologickou výrobu. Navzdory všem možným přínosům a ekonomickým výhodám však stále zdaleka nepochopíme genetické a buněčné procesy, které jsou základem morfogeneze křemičité schránky rozsivek, ačkoli tyto studie probíhají již od poloviny minulého století.

Klíčovým článkem jsou mikrotubuly

Křemičitá chlopeň rozsivek se tvoří ve specializované intracelulární organele – vezikule z nánosu oxidu křemičitého, obklopeném specifickou membránou – silikalemou. Dnes je známo, že cytoskelet hraje důležitou roli při tvorbě chlopně, zejména mikrotubulů, které byly u některých druhů rozsivek vizualizovány pomocí fluorescenční a konfokální mikroskopie. V experimentech, kde byly použity látky inhibující funkci mikrotubulů (kolchicin, lumikolchicin, oryzalin atd.), řasy vytvořily chlopně s různými anomáliemi.

Oddělení buněčné ultrastruktury Limnologického ústavu Sibiřské pobočky Ruské akademie věd jako první na světě studovalo roli cytoskeletu v morfogenezi chlopně na synchronizované kultuře rozsivek, kde se všechny buňky nacházejí ve stejné fázi buněčného cyklu. Synchronizace buněčných kultur rozsivek je relativně snadná: stačí je po určitou dobu uchovávat v médiu bez křemíku. Buňky zpočátku intenzivně spotřebují svůj uložený křemík na stavbu schránky a jakmile ho veškerý spotřebují, přestanou se dělit a v určité fázi životního cyklu se zastaví. Když se do média přidá křemík, buňky opět začnou proces tvorby nových chlopní a dělení.

Rozsivka se stala „pokusným králíkem“ Synedra acus subsp. radians – tato řasa je již několik let používána jako modelový objekt v LIN SB RAS pro studium všech aspektů morfogeneze chlopní a dobře se reprodukuje v laboratorní kultuře. V experimentech byly použity dva inhibitory funkce mikrotubulů s různými mechanismy účinku – kolchicin a poprvé paklitaxel. Kolchicin blokuje sestavování nových mikrotubulů vazbou na jejich rostoucí konce. Mikrotubuly, které prošly depolymerací, již nelze obnovit a brzy se zničí; po odstranění kolchicinu z média se obnoví. Paklitaxel naopak blokuje depolymeraci mikrotubulů vazbou na protein β-tubulin, což způsobuje tvorbu svazků mikrotubulů.

Experimenty na synchronizované kultuře Synedra ukázaly, že přidání kolchicinu v určitém bodě morfogeneze umožňuje získat nové formy oxidu křemičitého se specifickou strukturou (Kharitonenko et al., 2015). Největší počet chlopní s nerovnoměrnými a nerovnoběžnými řadami areol (otvorů) je tedy pozorován při přidání kolchicinu 1,5 hodiny po zahájení morfogeneze chlopní a největší počet zakřivených chlopní je pozorován po 0,5 hodině. Nejzajímavější je, že chlopně bez areol se objevují pouze při přidání kolchicinu 2,5 hodiny po zahájení morfogeneze! To platí i pro paklitaxel a při použití obou těchto inhibitorů závisí podíl chlopní s anomáliemi a povaha změn v jejich morfologii na fázi morfogeneze, ve které jsou inhibitory přidány do média s kulturou řas.

Účinek paklitaxelu však vede také k výskytu takových anomálií ve struktuře chlopně, které nejsou pozorovány v případě kolchicinu. Mezi ně patří velké otvory v chlopni (ojedinělé případy), stejně jako expanze chlopně, což je poměrně běžné při použití paklitaxelu v počátečních fázích morfogeneze.

Jak vyrobit „trubičku“ z „hrnku“

Zaměstnankyni LIN SB RAS, Naděždě Volokitinové, se podařilo izolovat další druh rozsivek v laboratorní kultuře – Aulacoseira islandica, který v určitých ročních obdobích dominuje bajkalskému fytoplanktonu. Morfogeneze této rozsivky, na rozdíl od Synedry, byla relativně málo prozkoumána. Zástupci rodu Aulaçoseira Chlopeň díky svému neobvykle vysokému ohybu připomíná „mikrošálku“ a buňky v koloniích jsou pevně spojeny speciálními spojovacími hroty.

Vzhledem k tomu, že tento druh má tenkou schránku, která se při manipulaci drtí a trhá, bylo při hodnocení vlivu inhibitorů na jeho morfogenezi rozhodnuto použít speciální fluorescenční barvivo, které je zabudováno do formujících se chlopní a umožňuje pozorovat výsledek experimentálního efektu v konfokálním mikroskopu.

S pomocí této technologie bylo možné ukázat, že v přítomnosti kolchicinu v kultuře se objevují srostlé dceřiné chlopně bez přepážky, tj. „mikrokašlíky“ se mění v „mikrotubuly“. Pokud je tedy buňce v určité fázi morfogeneze zabráněno v konstrukci „dna“ (přední části chlopně), bude následně pokračovat ve stavbě ohybu chlopně podle naprogramovaného scénáře, jako by stavitelé z nějakého důvodu nepostavili základy budovy a další tým pokračoval ve stavbě zdí nebo střechy.

Dnešní výzkum mechanismů tvorby chlopní rozsivek nám umožní v budoucnu využít tyto křemíkové bionanotechnologie ve prospěch lidstva, ačkoliv jsme nyní teprve na samém začátku této dlouhé cesty. Je možné, že další studium regulace práce mikrotubulů cytoskeletu rozsivek na buněčné a genetické úrovni umožní získat mutantní kultury řas a vytvořit křemičité struktury s požadovanými vlastnostmi „na vyžádání“.

Crawford R. M. Gibshuber I. Mini-nanoinženýři // SCIENCE First Hand. 2006. č. 4 (10). s. 48-54

Delalat B., Sheppard VC, Ghaemi SR a kol. Cílené podávání léků s využitím geneticky modifikovaného biooxidu křemičitého z rozsivek // Nature Communications. 2015. č. 6.

Dumontet C., Jordan MA Látky vázající se na mikrotubuly: dynamická oblast protinádorové terapie // Nat. Rev. Drug Discov. 2010 V. 9 P. 790–803.

Gale DK, Gutu T., Jiao J., Chang C.-H., Rorrer GL Fotoluminiscenční detekce biomolekul pomocí biooxidu křemičitého rozsivek funkcionalizovaného protilátkami. Advanced Functional Materials. 2009. V. 19. S. 926–933.

Gebeshuber I. Biotribologie inspiruje nové technologie // Nano dnes. 2007. V. 2 N. 5. S. 30-37.

Gordon, R. a B. D. Aguda. Morfogeneze rozsivek: přirozená fraktální tvorba komplexní mikrostruktury // Harris, G. a C. Walker, Sborník z výroční mezinárodní konference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, část 1/4: Kardiologie a zobrazování, 4.–7. listopadu 1988, New Orleans, LA, USA, New York: Institute of Electrical and Electronics Engineers. 1988. V. 10. S. 273–274.

Grachev MA, Annenkov VV, Likhoshway Ye. V. (2008) Silicon nanotechnologies of pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. V. 30. S. 328–337.

Sheppard V.C., Scheffel A., Poulsen N., Kröger N. Imobilizace živých rozsivek pomocí multimerních a redoxně aktivních enzymů na oxidu křemičitém // Appl Environ Microbiol. 2012. V. 78 N. 1. P. 211–218.

V publikaci jsou použity fotografie autorů

: 1. dubna 2019, „Přemýšlejte o vědě!“, sv. 81, č. 1